生物樣品多種多樣，但都具備三維結構。要研究其功能結構自然就要獲得其三維信息。獲得三維信息有許多方法，現階段人們常用的多是利用斷層掃描的方式獲得樣品內部逐層的斷層信息再經過三維重構處理進而獲得樣品的三維結構。
顯微鏡的發明開啟了生命科學微觀研究的大門，但人們為了獲得微觀樣品的三維結構卻經歷了漫長的歲月。這其中共聚焦顯微鏡的發明具有里程碑的意義，同樣在近些年流行起來的光片顯微鏡也另辟蹊徑實現了微觀樣品的斷層掃描成像。無論是通過共聚焦還是光片顯微鏡都是利用光學的方式而實現的斷層成像，因而人們一般都稱其為“光學切片”成像。
共聚焦顯微鏡各位讀者應該都比較熟悉。在我們日常的顯微成像工作中當提到“共聚焦顯微鏡”時往往是特指共聚焦顯微鏡中的一種——點掃描共聚焦顯微鏡！
其實嚴格來說“共聚焦顯微鏡”是一個大的分類，指通過共聚焦的方式實現熒光標記樣品光學切片的一類顯微鏡。
下文就讓我們來探究下接下來的幾個問題：
1）共聚焦顯微鏡的原理
2）共聚焦顯微鏡都有哪些？——點掃描及轉盤共聚焦
3）點掃描共聚焦與轉盤共聚焦的比較
4）光片顯微鏡的原理
5）光片顯微鏡與共聚焦顯微鏡的比較
1） 共聚焦顯微鏡的原理
讓我們通過圖示來簡單了解一下共聚焦的原理。
如圖綠色的平行激光進入光路通過物鏡被匯聚到物鏡的焦點上，樣品被綠光激發發出紅光。這里我們要注意在焦點上下的空間也會被綠光激發，同樣也會發出紅色的發射光。
我們先只考慮從焦點發出的光（既圖示中的粉紅色）其再返回物鏡并經筒鏡再次匯聚到共焦點的位置，也就是針孔的位置（針孔就是一透光的小孔），那么來自焦點的光線自然可以順利的通過針孔。
焦點之外的光線（圖中藍線所示）會匯聚在共焦點之外的位置，所以就不能順利的通過針孔。
如此一個簡單的針孔結構就可以將來自焦點之外的光線過濾而只保留焦點上發出的光線了。
因此“共聚焦”正可以表示這一通過共焦點的方式而排除焦外光線干擾的成像方式。
2）共聚焦顯微鏡都有哪些？
其實上面的故事還沒有結束！通過共聚焦的方式利用針孔過濾掉焦點外的干擾后，但實際上我們只獲得了一個點的信號。
我們如何獲得一張完整的圖像呢？答案是——掃描。逐點掃描即可得到一張完整的來自一個焦平面的圖像，這樣我們才最終實現了對樣品的所謂光學切片。
那么如果只有一個點在掃是不是顯得效率有點低下？實際上早已有人嘗試了不同的針孔模式，如下圖?？梢杂靡粭l線來掃，這時可以稱為線掃描共聚焦?？梢杂靡慌判】讈頀?，更可以用一片小孔來掃描，這時都可以稱為多點掃描共聚焦。
但經過多年的發展，線掃描和單排小孔掃描的方式已經基本被市場淘汰。而只剩下上圖最右的多點掃描方式。
這類掃描方式是通過下圖所示的轉盤而實現的。如圖轉盤上成一定規律螺旋分布著眾多小孔。當轉盤旋轉時眾多針孔劃過的空間會逐漸疊加而最終完整覆蓋掃描的區域。
由于轉盤共聚焦眾多針孔同步掃描，使其掃描通量可以大大的超過點掃描共聚焦。進而獲得遠高的掃描速度及通光量。
由于轉盤共聚焦需要同時檢測眾多點的信號，所以需要使用相機進行成像?，F階段最新的相機具備出色的速度（可超過100fps）和極為出色的靈敏度（光電轉換效率可達95%）。轉盤共聚焦本身的高通光量再疊加相機的高靈敏度，使其非常適合微弱熒光樣品的成像。而且轉盤共聚焦可以利用很弱的激發光而獲得不錯的圖像，再結合其極高的速度（單次照射時間短），這兩者疊加又使其具備非常低的光毒性。
3）點掃描共聚焦與轉盤共聚焦顯微鏡的比較
由于現今在共焦成像領域幾乎都是使用點掃描共聚焦及轉盤共聚焦。其中又以點掃描共聚焦居多（在國內可能占有80%以上的比例），所以當人們在談到“共聚焦”的時候一般都是只點掃描共聚焦。
前文我們談到其實轉盤共聚焦具備了速度快、靈敏度高及光毒性低的三大優勢，但為什么轉盤沒有代替點掃描共聚焦呢？
事物都具有兩面性，我們先看下圖。第一轉盤具有眾多小孔，在技術上我們是無法調節其大小的（b圖D值）。只能讓其匹配某一顆物鏡，比如圖中的D為50um，此直徑剛好匹配100X物鏡，當使用低倍物鏡時都大于最佳的針孔大小而使其切層效果變差。
第二針孔間距（b圖S值）越小可以獲得更快的速度和更高的通光量但同時會更容易通過其他位置焦面外熒光的干擾（e，f圖中邊緣的小孔獲得了中間位置焦面外的熒光干擾）這就同時削弱了成像的分辨率和切層效果。但小孔間距過大的話，相反的其速度和圖像亮度就會大大的削弱。
第三轉盤共聚焦使用相機作為成像設備，其也帶來一個不足就是相機的像素尺寸是固定的，使其無法匹配不同的應用需求。當選擇大像素時圖像亮度高，但使用低倍物鏡會分辨率偏低。當使用小像素時分辨率好一些但圖像亮度又會偏低。
而與此相反點掃描共聚焦可以很好的解決上面的問題。第一針孔可調可以完美匹配任何物鏡和任何激光。第二只有一個針孔沒有任何的相鄰針孔干擾。
第三沒有所謂的像素尺寸，而且可以以任意的調整掃描區域及掃描的分辨率。完美匹配樣品的分辨率與形狀及方向（見下圖）。
此外由于點掃描共聚焦的激光只集中在一個點上，而具備極高的光密度，使其可以十分充分的激發熒光。特別是對于固定樣品（由于不需要再次使用而不必太在乎光漂白及光毒性）點掃共聚焦可以獲得明亮清晰的圖像。
點掃描共聚焦可以非常充分的激發而獲得十分出色的畫質。而且不同廠家也推出了結合共振掃描的高速點掃共聚焦，如此可以在一定程度上拉近與轉盤的速度差距?？梢詤⒖寄峥礎X共聚焦共振掃描介紹。
簡單總結，點掃共聚焦具有普遍的適用性，適用于各種物鏡，各種常規樣品的從宏觀到微觀細胞亞結構的觀察。轉盤共聚焦適用于對速度有迫切要求的實驗（如大批量切片掃描，肌肉鈣離子等運動樣品）及對光毒性較敏感樣品（如胚胎觀察）的三維拍攝。
4）光片顯微鏡的原理。
光片熒光顯微鏡（Light Sheet Fluorescence Microscopy）這一形象的名稱可以讓我們很容易理解其工作方式。如下圖，既是用片層狀的照明從側面照射樣品，這樣只有這一斷層上的樣品才被照亮，另一成像物鏡在上側直接拍攝就可以得到這一斷層的圖像。然后通過樣品的上下移動就可以獲得樣品中完整的三維信息。
5）光片顯微鏡與共聚焦顯微鏡之比較。
光片顯微鏡具有相比共聚焦更佳的光線利用率。因為共聚焦需要利用針孔過濾，所以實際樣品所發出的熒光并不能全部利用。而光片顯微鏡的全部熒光都會被用來收集成像。
因此光片顯微鏡會有比轉盤共聚焦更快的速度，更高的靈敏度及更低的光毒性！這些特性使其非常適合脆弱樣品的極高速三維成像。
但光片顯微鏡也存在諸多的限制。一是由于采用側面照明而幾乎所有的常規切片和培養皿的樣品都無法觀察，體積較大的樣品也由于照明無法穿過而無法觀察。二是由于都要觀察一定體積的樣品而需要很長工作距離的物鏡（一般固定使用一顆物鏡），這大大限制了成像分辨率。所以現階段比較適合的樣品是各類胚胎初期的觀察，較小的組織塊及透明化的大一些的樣品，并且一般是用于細胞群體的觀察，對細胞亞結構的觀察就比較吃力了。
如果我們把點掃、轉盤、及光片顯微鏡在速度、靈敏度、光毒性、深度、畫質及適用性方面來區分的話可以概略的得到下圖：
我們通過上圖再專門看一下其適用性。顯然點掃共聚焦可以適應更廣泛的樣品，所以日常的科研也使用的最多。其次是轉盤共聚焦，也可以利用各種物鏡，但主要是用于對速度有很高要求的應用。對于光片顯微鏡就只能局限于特異的樣品，但卻具備出色的速度表現。
本文由于篇幅所限，我們只簡單介紹了點掃、轉盤及光片這三種三維顯微成像工具。其他還有多光子共聚焦，結構照明，還有反卷積軟件算法等多種技術可以實現熒光樣品的三維成像。也有不使用熒光技術的全息顯微鏡，也可以得到樣品的三維信息。
此外各類超分辨顯微技術也可以得到樣品的三維數據。
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